Газожидкостная хроматография.

В газожидкостной хроматографии (ГЖХ) подвижной фазой служит газ, а неподвижной фазой является жидкость, которая либо нанесена на внутреннюю поверхность колонки (капиллярная колонка), либо на твердый носитель, например диатомовую землю, порошок тефлона или мелкие стеклянные шарики (насадочная колонка). Жидкая фаза для нанесения предварительно растворяется в летучем растворителе, таком, как эфир. Например, мелкие стеклянные шарики погружают в раствор полиэтиленгликоля в эфире и после того, как эфир улетучится, каждый шарик оказывается покрытым слоем полиэтиленгликоля. При температуре, которая обычно используется в газожидкостной хроматографии, полиэтиленгликоль плавится и остается на шариках в виде жидкой пленки. Образец, представляющий собой вещество, способное испаряться без разложения, вводят в жидком состоянии с инертным газом, например гелием, аргоном или азотом, и затем нагревают. Образующаяся газовая смесь проходит через колонку по схеме, показанной на рисунке справа.

 

 

Насадочные колонки обычно имеют диаметр около 0,5 см и длину от 1 до 20 м. Длина капиллярных колонок обычно колеблется в пределах от 30 до 100 м. Для достижения особенно хорошего разрешения применяются капиллярные колонки до 2 км в длину.

 

 

Испаренные вещества постоянно перераспределяются между подвижной газовой фазой и неподвижной жидкой фазой в соответствии с их коэффициентами распределения, в результате чего и происходит хроматографирование. На конце колонки находится подходящий детектор.

 

 

В практике аналитической хроматографии обычно применяют три типа детекторов: катарометр, или детектор по теплопроводности (чувствительность около 10 мкг), аргоновый ионизационный детектор (чувствительность до 10^-5 мкг) и пламенно-ионизационный детектор (чувствительность около ^-5 мкг).

 

 

Наша лаборатория проводит анализ липидов на хроматографах Shimadzu-9A и Shimadzu-14A c пламенно-ионизационным детектором. Для разделения веществ используются как полярные, так и неполярные колонки.

Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) первоначально была разработана для разделения липидов. Хотя хроматография на бумаге быстрее, чем хроматография на колонке, к недостаткам ее следует отнести то, что бумага может быть изготовлена только из материалов на основе целлюлозы, что не позволяет применять ее для разделения неполярных веществ. Тонкослойная хроматография сохраняет все преимущества хроматографии на бумаге, но при этом позволяет использовать любой материал, который можно тонко измельчить и получить затем однородный слой. Это могут быть неорганические вещества, например силикагель, окись алюминия, диатомовая земля и силикат магния, а также органические вещества, в частности целлюлоза, полиамиды и порошок полиэтилена.

Пластинку с закрепленным сорбентом помещают в камеру, содержащую растворитель, и проявляют восходящей хроматографией. После того как фронт растворителя почти достигнет верхнего края, пластинку вынимают из камеры и сушат. Для получения двумерной хроматограммы высушенную пластинку можно повторно хроматографировать под прямым углом в другом растворителе. Положение пятен, как и при хроматографии на бумаге, определяют по окраске, по флуоресценции или при опрыскивании различными реагентами, которые реагируют с веществами в пятне с образованием окрашенных продуктов. Обычно используют следующие реагенты: нингидрин для аминокислот, родамин В для липидов, хлорид сурьмы для стероидов и терпенов, серную кислоту с последующим нагреванием практически для всех органических соединений (происходит обугливание), перманганат калия в серной кислоте для углеводородов, анисовый альдегид в серной кислоте для углеводов, пары брома для олефинов и т. д. Вещества можно элюировать путем соскребания.

Хроматография

Одной из основных задач биохимии, и липидологии в частности, является разделение и идентификация химических соединений. Хроматография — очень эффективный метод для достижения этой цели. Общеизвестно, что метод был разработан в 1906 г. русским ботаникомМихаилом Цветом, который разделял растительные пигменты (отсюда и название); однако следует отметить, что в 1855 г. немецкий химик Карл Рунге применил хроматографию на бумаге для разделения неорганических веществ. Более того, Плиний Старший сообщал о разделении красителей на папирусе и существовании хроматографического теста на железо с использованием папируса. Все же хроматография стала по-настоящему серьезным методом только в 1944 г., после работ Арчера Мартина и Джона Синджа, получивших Нобелевскую премию за разработку методологии распределительной хроматографии.

В настоящее время известно большое число различных видов хроматографии (адсорбционная, распределительная, ионообменная, на молекулярных ситах) и различных приемов их применения (колоночная, на бумаге, тонкослойная, газовая). Это обусловлено тем, что хроматография может использоваться для решения разнообразных задач, начиная от получения относительно больших количеств чистого вещества и кончая аналитическими процедурами, позволяющими идентифицировать какие-либо вещества.

Теоретические основы распределительной хроматографии.

Сильно различающиеся между собой вещества, например железные опилки и частицы стекла, легко можно разделить с помощью магнита; сахар и песок разделяются путем растворения сахара в воде. Однако, если вещества обладают сходными физическими и химическими свойствами, процесс разделения сильно усложняется. Принцип хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента — подвижную инеподвижную (стационарную) фазы и в которой разделение по типам молекул происходит за счет различий (часто весьма незначительных) в распределении между этими двумя фазами. Относительная подвижность каждой молекулы зависит от соотношения между движущей силой, которой здесь является движение подвижной фазы, и силами удерживания, к которым в первую очередь следует отнести распределение и адсорбцию.

В распределительной хроматографии принята следующая терминология. Стационарная фаза называется сорбентом. Если сорбент представляет собой жидкость, которая удерживается какимлибо твердым телом, это тело носит название носителя или матрицы. Подвижная фаза называется растворителем или проявителем, а компоненты разделяемой смеси —растворенными веществами.

Распределительная хроматография основана на следующем:
еcли две фазы находятся в контакте друг с другом, причем одна из них или обе содержат растворенное вещество, это вещество будет распределяться между двумя фазами. Этот процесс именуется распределением и количественно описывается коэффициентом распределения, представляющим собой отношение концентраций растворенного вещества в каждой из двух фаз.

Рассмотрим распределительную хроматографию на колонке, где колонкой служит трубка, заполненная сорбентом и растворителем. Раствор, содержащий разделяемую смесь, вводят в колонку так, чтобы растворенные вещества проникли в сорбент. Затем через колонку пропускают растворитель. Хотя сорбент и растворитель распределены по всей колонке равномерно, колонку можно рассматривать как совокупность множества отдельных слоев («теоретических тарелок»), каждый из которых содержит две фазы. Представим, что 256 идентичных молекул,которые равномерно распределяются между неподвижной и подвижной фазами, введены в колонку с 18 теоретическими тарелками (верхний рисунок справа далее по тексту). В верхней теоретической тарелке (начальной) 256 молекул распределены так, что в каждой фазе находится по 128 молекул. При переходе 128 подвижных молекул с первой теоретической тарелки па вторую они распределяются на ней по 64; оставшиеся на первой теоретической тарелке 128 молекул перераспределяются по 64 в каждой фазе, как показано на рисунке. При продвижении подвижных фаз еще на одну теоретическую тарелку снова происходит перераспределение. После 20 последовательных переносов достигается состояние, изображенное на рисунке. Предположим, что на первой теоретической тарелке находится 256 молекул другого типа (на рисунке цифры снаружи колонки), которые в 3 раза больше распределяются в неподвижную фазу. На рисунке показано также их распределение после 20 переносов. Распределение этих двух видов молекул сильно различается, поэтому в результате отделяется значительная часть молекул. Чем больше число теоретических тарелок (т. е. длина колонки), тем лучше разделение. Следует отметить, что при увеличении числа теоретических тарелок вещество распределяется по большей части колонки. В действительности, когда число молекул огромно (т. е. больше 10¹⁶), число молекул на первой теоретической тарелке отличается от нуля. С другой стороны, степень распределения уменьшается в том смысле, что большая доля вещества находится на небольшой части теоретических тарелок. Например, после 8 переносов 40% молекул, которые на рисунке распределяются 1:1, содержится в ⁴/₈ теоретических тарелок, после 20 переносов 40% содержится уже в ⁶/₁₆, или ³/₈, теоретических тарелок. Отсюда ясно, что в идеальном случае, когда разделение определяется только распределением, разделение двух веществ будет более эффективным при увеличении длины колонки.

Примеры распределительной хроматографии.

Чаще всего используют два типа распределительной хроматографии — хроматографию на бумаге и тонкослойную. В обоих случаях носитель содержит связанную жидкость: молекулы воды связаны с целлюлозой при хроматографии на бумаге, а при тонкослойной хроматографии с носителем связан растворитель, используемый для получения тонкого слоя. (Эти методы иногда рассматривают как разновидность адсорбционной хроматографии, поскольку степень разделения зависит и от эффектов адсорбции, однако основным процессом здесь является распределение.) Другим примером распределительной хроматографии служит газожидкостная хроматография.

В первом положении фосфо- и нейтральных глицеролипидов могут быть остатки не жирных кислот, а жирных спиртов (алкильная связь) или альдегидов (алкенильная).

Во втором положении связь всегда сложноэфирная. Следовательно, могут быть три формы липидов: диацильная (А), алкилацильная (Б) и алкенилацильная (В).

Для липидов группы В есть специальный термин — «

плазмалогены

».

Три типа связей существенно различаются по устойчивости к кислотам и щелочам. Алкильная и алкенильная связи значительно устойчивее ацильной и к действию ферментов.

Плазмалогены широко распространены в природе: характерны для животных, присутствуют в некоторых бактериях. Они могут составлять более 50% всего фосфатидилэтаноламина мозга и половину фосфатидилхолина сердца млекопитающих. У некоторых морских беспозвоночных фосфатидилэтаноламин на 90% состоит из алкенильной формы.

Среди липидов группы Б наибольший интерес привлекает

фактор активации тромбоцитов

(ФАТ) — липид с очень высокой биологической активностью.
Как следует из названия, он активирует тромбоциты. Для этого достаточны миллионные доли миллиграмма ФАТ. Он также снижает давление крови, вызывает воспалительные реакции. Замена алкильной связи на алкенильную или ацильную резко снижает активность ФАТ. Повышенное образование ФАТ наблюдается при разных заболеваниях. Поэтому довольно большое внимание уделяют поиску ингибиторов синтеза ФАТ как лекарственных средств.

 

Фосфолипиды являются одними из основных компонентов биомембран, среди них есть биологически активные вещества, они довольно широко используются в пищевой и фармацевтической промышленности.

Рассмотрим кратко некоторые фосфолипиды (см.структурные формулы, отобранные по степени распространенности в природе и важности биологической роли).

Фосфатидилхолин - главный фосфолипид большинства типов животных. Его содержание обычно составляет не менее 50% суммы фосфолипидов. Вторым по значению фосфолипидом у животных обычно является фосфатидилэтаноламин. В большинстве бактерий фосфатидилхолина нет, а более 60—70% их фосфолипидов составляет фосфатидилэтаноламин. Оба липида присутствуют в большинстве растений, для этих организмов очень важен фосфатидилглицерин. Это единственный фосфолипид синезеленых водорослей, главный фосфолипид фотосинтетического аппарата всех растений. Сфингомиелин является важным компонентом клеток эволюционно продвинутых типов животных. В эритроцитах некоторых млекопитающих, в частности овец, он заменяет фосфатидилхолин в качестве главного фосфолипида. Заслуживают упоминания и несколько других фосфолипидов: фосфатидилинозит, дифосфатидилглицерин (кардиолипин), фосфатидилсерин, фосфатидная кислота.